Nature Biotechnology：当干细胞“伪装”成精子？一把开启“超级牛羊”时代的钥匙

生命乐章的奏响，通常始于两个单倍体细胞，精子和卵细胞的融合。它们各自携带一套完整的染色体（单倍体，haploid），结合后形成拥有两套染色体（二倍体，diploid）的受精卵，并最终发育成一个完整的生命体。精子，作为雄性遗传信息的唯一载体，其重要性不言而喻。然而，它有一个 致命 的缺点：无法在体外进行培养和增殖。这意味着研究人员无法像编辑普通细胞那样，对精子进行从容、精准的基因改造。

那么，能否找到一种完美的替代品呢？理想的替代者需要满足两个苛刻的条件：首先，它必须是单倍体的，只携带一套来自父方的染色体；其次，它必须具备干细胞的 无限潜能 （多能性，pluripotency），能够在体外稳定传代，并作为基因编辑的理想平台。这种细胞，就是单倍体雄性胚胎干细胞 (haploid androgenetic embryonic stem cells, haES cells)。

在小鼠等啮齿类动物中，haES细胞的建立已不是新闻，它们被成功用于制造转基因动物，极大地推动了生命科学研究。但在牛、羊这类重要的大型反刍动物中，haES细胞的建立却是一片无人涉足的处女地，这构成了家畜遗传改良领域的一大技术瓶颈。

该研究的首要任务，便是攻克这一难题。研究人员采用了两种巧妙的方法来创造单倍体的牛、羊胚胎。第一种方法是 偷梁换柱 ：将精子注入一个已经 失忆 （被摘除细胞核）的卵母细胞中。第二种方法是 去伪存真 ：在正常的体外受精 (in vitro fertilization, IVF) 形成受精卵后，通过显微操作精准地移除携带母源遗传物质的雌性原核。

通过这两种方式获得的单倍体胚胎，其发育效率几乎没有差异。例如，在牛的实验中，通过注射法获得的胚胎有31.16%发育到囊胚阶段，而通过移除法获得的胚胎则有30.21%发育到囊胚。虽然这一比例低于正常IVF胚胎的68.84%，但已经为下一步分离干细胞提供了充足的 原料 。

接下来是最关键的一步：从这些珍贵的单倍体囊胚的内细胞团 (inner cell mass, ICM) 中分离并建立稳定的干细胞系。研究人员尝试了多种已知的干细胞培养体系，但都以失败告告终。最终，通过对多种小分子化合物的反复筛选和优化，他们开发出了一种全新的、被命名为 FACE 的培养基。在这个独特的化学环境中，牛和羊的haES细胞终于得以成功建立，并且能够稳定传代超过80代。

这些来之不易的细胞，是否真的具备干细胞的 魔力 ？研究人员进行了一系列严格的功能验证。在体外，这些haES细胞可以分化形成包含三个胚层（外胚层、中胚层和内胚层）的 embryoid bodies (EBs)。当被注射到缺陷小鼠体内时，它们能够形成 (teratoma)，瘤内同样包含了神经、肌肉、腺体等多种组织，这是多能性的黄金标准。更有力的是，当研究人员将这些标记了绿色荧光蛋白 (EGFP) 的牛haES细胞注入牛的早期胚胎中，它们能够成功地整合进去，发育成嵌合体动物，证明了其在真实胚胎环境中的发育潜力。

至此，一个理想的 精子替代品 平台终于搭建完成。这些牛、羊haES细胞，既是单倍体，又具备多能性，为后续的遗传操作打开了一扇前所未有的大门。

拥有了能在体外培养和编辑的 单倍体种子 ，下一步自然是验证它能否像真正的精子一样，与卵母细胞结合，创造出新的生命。研究人员将这个过程命名为 胞浆内haES细胞注射 (intracytoplasmic haES cell injection, iCHI)，以类比临床上常用的 胞浆内单精子注射 (intracytoplasmic sperm injection, ICSI) 技术。

他们将一个haES细胞小心翼翼地注入成熟的卵母细胞中。理论上，这个细胞的细胞核应该在卵母细胞的细胞质环境中被 重编程 ，形成一个雄性 假原核 (pseudo-pronucleus)，并与卵母细胞自身的雌性原核结合，启动胚胎发育。

然而，实验结果却给研究团队泼了一盆冷水。无论是牛还是羊，通过iCHI技术构建的重构胚胎，其发育能力都极其低下。绝大多数胚胎在发育早期就陷入停滞，无法抵达囊胚阶段。数据显示，在牛的实验中，iCHI胚胎的囊胚形成率仅为27.1%，远低于IVF对照组的68.8%。羊的实验也呈现出类似的结果，iCHI胚胎的囊胚形成率只有24.2%，而IVF对照组为53.7%。

这无疑是一个巨大的障碍。细胞是活的，遗传物质是完整的，为什么它们就无法支持正常的胚胎发育呢？问题出在哪里？

研究人员首先将怀疑的目光投向了DNA甲基化，尤其是印记基因 (imprinted genes)。印记基因是一类特殊的基因，它们的表达与否取决于其遗传自父亲还是母亲。这种 亲源记忆 是通过DNA甲基化修饰来实现的。如果haES细胞在体外培养过程中丢失了正确的父本印记，那么重构胚胎的发育必然会受到严重影响。然而，通过对包括H19、IGF2等关键印记基因的检测，研究人员发现，这些haES细胞完美地保持了与精子一致的父本印记模式。

排除了DNA甲基化的嫌疑，研究人员将侦查范围扩大到了染色质的另一重要组成部分，组蛋白 (histone)。

如果说DNA是生命的蓝图，那么组蛋白就是承载并这张蓝图的卷轴。DNA长链缠绕在组蛋白八聚体上，形成核小体，进而被层层压缩，装进小小的细胞核。组蛋白并非一个被动的支架，其尾部可以被加上各种各样的化学修饰，如甲基化、乙酰化等，这就是所谓的 组蛋白密码 。这些修饰调控着DNA的松紧程度，决定了哪些基因应该 开启 ，哪些基因应该 关闭 。这种不改变DNA序列本身，但能影响基因表达的调控机制，被称为表观遗传学 (epigenetics)。

在正常的受精过程中，来自精子的雄原核和来自卵子的雌原核，它们的组蛋白修饰状态是截然不同的，即 不对称的 (asymmetric)。这种不对称性对于后续胚胎的正确发育至关重要。

那么，iCHI胚胎中的情况又是怎样的呢？研究人员利用免疫荧光染色技术，仔细观察了重构胚胎原核中的几种关键组蛋白甲基化修饰，包括H3K4me3（通常与基因激活相关）、H3K9me3和H3K27me3（通常与基因抑制相关）。

结果令人震惊。在正常的IVF胚胎中，这些修饰在雄原核和雌原核中呈现出明显的不对称分布。然而，在iCHI胚胎中，由haES细胞形成的假原核，其组蛋白修饰模式与雌原核几乎完全一致，呈现出 对称的 (symmetric)状态。这意味着，haES细胞核进入卵母细胞后，并没有成功地抹去其作为体细胞的 表观遗传记忆 ，而是错误地保留了这些不应存在的组蛋白修饰。

这些错误的 记忆幽灵 如同发育道路上凭空出现的交通信号灯，扰乱了胚胎基因表达的正常程序，最终导致了大规模的发育停滞。研究人员甚至尝试通过向胚胎中注射相应的组蛋白去甲基化酶的mRNA来纠正这些错误，但收效甚微，甚至加速了haES细胞的自我二倍体化，这表明简单的 删除 操作并不能解决根本问题。

谜底已经揭晓：阻碍iCHI胚胎发育的，是haES细胞核上顽固的组蛋白修饰。如何才能彻底驱散这些 幽灵 呢？

面对这一棘手的表观遗传障碍，研究人员从自然界的精子发生 (spermatogenesis) 过程中获得了灵感。在精子成熟的最后阶段，细胞核内的组蛋白会被一种叫做鱼精蛋白 (protamine)的小分子蛋白质大量替换。这个过程不仅能将DNA以前所未有的密度进行压缩，使其能够被装入小小的精子头部，更重要的是，它几乎清除了细胞核中所有的组蛋白及其携带的表观遗传信息，让精子细胞核回归到一种 表观遗传的原始状态 。

这给了研究人员一个大胆的启发：我们是否可以人为地在haES细胞中启动这个 鱼精蛋白化 过程，让它的细胞核提前进行一次 格式化 ，从而模拟出精子细胞核的状态？

他们构建了一个可以被诱导表达的鱼精蛋白基因 (PRM1) 的载体，并将其转入牛和羊的haES细胞中。在加入诱导剂后，奇妙的景象发生了：haES细胞的细胞核开始逐渐凝缩，形态上越来越像晚期的精子细胞（圆形精子细胞）。更关键的是，通过免疫荧光检测，研究人员发现，随着鱼精蛋白的表达，那些原本顽固存在于细胞核中的H3K4me3、H3K9me3和H3K27me3修饰，被高效地清除了！

经过48小时的鱼精蛋白诱导处理，这些haES细胞已经成功 伪装 成了精子细胞的模样。研究人员将这种经过处理的细胞用于胞浆内注射，并将这一全新的技术命名为 鱼精蛋白化的iCHI (Pro-iCHI)。

这一次，奇迹发生了。

用经过 伪装 的haES细胞构建的Pro-iCHI胚胎，其发育状况发生了戏剧性的改善。在牛的实验中，Pro-iCHI胚胎的囊胚形成率飙升至64.9%，与IVF对照组的68.8%几乎没有学差异。在羊的实验中，囊胚率也达到了51.2%，与IVF的53.7%旗鼓相当。

这意味着，通过模拟精子成熟过程中的关键一步，研究人员成功地克服了最主要的表观遗传障碍。他们将这些高质量的Pro-iCHI胚胎移植到代孕母牛和母羊体内。令人振奋的是，这些胚胎成功着床并发育。最终，研究人员获得了健康的后代。其中，一头通过Pro-iCHI技术诞生的母牛，在长大后通过自然交配，成功产下了自己的后代，证明了这项技术的生物安全性及其培育个体的正常生育能力。

Pro-iCHI技术的成功，不仅仅是创造了一种新的繁殖方式，更重要的是，它验证了一个功能强大的技术平台的闭环：单倍体干细胞的体外基因编辑 + Pro-iCHI技术介导的胚胎重建。

为了展示这一平台的巨大应用潜力，研究人员选择了一个在家畜育种中极具价值的明星基因，肌肉生长抑制素(myostatin, MSTN) 基因。这个基因的功能如同其名，是肌肉生长的 刹车 。如果抑制或敲除这个基因，动物的肌肉会异常发达，形成所谓的 双肌 (double-muscling)表型，这在肉牛和肉羊育种中是梦寐以求的优良性状。

研究人员利用 引导编辑 (prime editing, PE)的高效基因编辑工具，在牛和羊的haES细胞中对MSTN基因进行了精确的改造。在牛haES细胞中，他们精确地删除了MSTN基因外显子上的11个碱基对；在羊haES细胞中，则实现了一个关键位点的G到A的单碱基替换。由于haES细胞只有一个拷贝的基因，编辑的成功与否一目了然，筛选过程也变得异常简单。在细胞水平，编辑效率几乎达到了100%。

在获得了纯合的基因编辑haES细胞系后，研究人员启动了Pro-iCHI程序。他们将这些携带了 双肌 潜能的细胞核注入卵母细胞，并将重构胚胎移植到代孕母体。

最终，通过Pro-iCHI技术，他们成功获得了2头MSTN基因编辑的活体小牛（移植15枚胚胎，成功率为13.3%）和1头MSTN基因编辑的羔羊胎儿。这些小牛出生后健康成长，并逐渐展现出肌肉更加丰满的特征，初步验证了基因编辑的效果。这一成功案例有力地证明，Pro-iCHI技术平台能够将复杂的体外基因操作，高效、可靠地转化为活生生的遗传改良个体。

这项发表在《自然 生物技术》上的研究，无疑是生命科学和农业科技领域的一项里程碑式的成就。它系统性地解决了长期困扰大型家畜遗传改良的多个核心难题。

首先，它提供了首个稳定、可靠的反刍动物单倍体胚胎干细胞平台，这本身就是干细胞生物学和发育生物学领域的一大突破。这些细胞不仅是进行功能基因组学研究（如基因筛选）的宝贵工具，也为深入探索哺乳动物配子发生和早期胚胎发育的奥秘提供了全新的视角。

其次，通过巧妙地运用鱼精蛋白 格式化 细胞核的策略，Pro-iCHI技术克服了利用干细胞进行胚胎重建时的主要表观遗传障碍。这一发现深刻地揭示了精子细胞核独特的表观遗传状态在启动生命程序中的关键作用。相比于传统的体细胞核移植（克隆技术）常常伴随的 大胎儿综合征 等发育异常问题，Pro-iCHI技术产生的后代在体重等方面与正常IVF后代更为接近，显示出更好的发育安全性。

最重要的是，这一技术将单倍体干细胞的无限可塑性与高效的胚胎生产相结合，为家畜的精准育种开辟了一条全新的高速公路。研究人员可以在细胞水平上，从容不迫地进行复杂的、多基因的精确编辑，待获得理想的细胞系后，再通过Pro-iCHI技术一步到位地生产出遗传改良的个体。这大大缩短了育种周期，提高了育种效率和精确度，其潜力远超传统育种技术。

当然，任何一项颠覆性技术在走向成熟的道路上都还有很长的路要走。尽管Pro-iCHI技术极大地提升了囊胚的形成率，但移植后的着床率和足月发育率仍有提升空间。研究发现，部分Pro-iCHI胚胎在植入后出现了生长迟缓和凋亡增加的现象，这表明可能还存在其他未知的表观遗传障碍或调控机制有待探索和优化。

但无论如何，这扇通往未来的大门已经被推开。这枚被巧妙 伪装 的干细胞，如同一个携带了可编程 基因剪刀 的超级快递员，能够精准地将我们设计的遗传蓝图递送到下一代生命中。未来，这项技术或许不仅能用于培育高产、优质、抗病的 超级牛羊 ，还有可能应用于濒危物种的保护，甚至为理解人类生殖与发育的奥秘提供深刻的启示。生命密码的编辑，正进入一个更加大胆和精准的新纪元。