Nature Biotechnology：从“细菌毒素”到“基因剪刀”！DNA“粘贴”编辑术开启新纪元，T>A精准突变成可能

在深入探讨这项新技术之前，我们先来看看它的核心部件 DNA ADP核糖基化（DNA ADP-ribosylation, ADPr）修饰，以及执行这一功能的奇特蛋白DarT2。

ADP核糖基化是细胞内一种至关重要的翻译后修饰过程，它就像一个多功能的分子开关，参与调控DNA修复、细胞凋亡和应答等多种生命活动。通常，我们谈论的是蛋白质的ADP核糖基化。然而，在激烈的生存竞争中，细菌进化出了一套独特的防御系统，可以直接对DNA进行修饰。DarT2蛋白便是一个典型的例子，它属于细菌的毒素-抗毒素系统（toxin-antitoxin system）的一部分。

想象一下细菌与噬菌体（bacteriophage）之间永恒的 军备竞赛 。在这个系统中，DarT2是 毒素 ，平时被其伴侣蛋白 抗毒素 DarG所中和。当噬菌体入侵时，抗毒素DarG被某种机制失活，DarT2毒素便被激活。激活后的DarT2会利用细胞内的NAD+作为底物，将ADP核糖基（ADPr）基团共价连接到DNA分子的胸腺嘧啶（T）碱基上。这种修饰对于噬菌体是致命的，因为它会在噬菌体DNA复制过程中制造障碍，从而阻止病毒的繁殖。

这个障碍是如何形成的呢？ADP核糖基基团本身非常庞大，当它被 粘贴 到DNA链上时，会严重扭曲DNA双螺旋结构。当DNA聚合酶沿着模板链进行复制时，一旦遇到这个庞大的ADPr加合物，就会像火车遇到巨石一样被迫停滞。这种复制停滞（replication stall）是细胞中一个强烈的 警报信号 ，它会迫使细胞启动一系列复杂的DNA修复途径来解决这个 路障 。

研究人员首先在体外实验中验证了DarT2的这一基本功能。他们设计了一条含有DarT2识别基序的单链DNA模板（ssDNA template），该基序具体为5 -TCTC-3 。当他们将这条模板与DNA聚合酶一起孵育时，聚合酶可以顺利地将其完全延伸，产生长度为60个核苷酸（nt）的产物。然而，当他们先用活性的EPEC DarT2蛋白处理这条ssDNA模板后，情况发生了根本变化：聚合酶在TCTC基序处戛然而止，只能产生约29 nt的短片段，无法完成全长复制。作为对照，如果使用催化失活的DarT2突变体（dDarT2），或者将识别基序突变为5 -ACTC-3 ，复制过程则不受影响。这一结果清晰地表明，DarT2能够特异性地在其识别位点上附加ADPr基团，并形成一个物理屏障，有效阻断DNA聚合酶的前进。

正是这种强大的复制阻断能力，让研究人员看到了将其改造为基因编辑工具的潜力：既然我们知道这个修饰会迫使细胞进行修复，那么我们是否能通过人为控制这个过程，引导细胞按照我们设计的蓝图来修复DNA呢？

要将DarT2从一个 无差别攻击 的毒素转变为 指哪打哪 的编辑工具，关键在于实现精准递送。研究人员采用了CRISPR-Cas9系统作为导航。他们将DarT2蛋白与一个Cas9切口酶（nickase, nCas9）融合在一起。

这里的选择非常巧妙。为什么是切口酶，而不是具有双链断裂（double-strand break, DSB）活性的标准Cas9核酸酶？标准Cas9造成的DSB对细菌而言毒性极强，容易导致细胞死亡。而Cas9切口酶只切断DNA双螺旋中的一条链，毒性大大降低。更重要的是，当Cas9切口酶结合靶点时，会形成一个称为R-loop的结构，其中一条DNA链与sgRNA配对，另一条DNA链则以单链形式暴露出来。这恰好为DarT2提供了理想的工作环境，因为DarT2正是在单链DNA上进行ADP核糖基化修饰的。因此，这个融合蛋白的工作流程是：nCas9负责定位和 开路 ，DarT2负责在暴露的单链上 粘贴 ADPr标记。

研究人员在大肠杆菌（E. coli）中设计了一个精巧的报告系统来检验 附加编辑 的效果。他们在细菌基因组上整合了一个 损坏 的卡那霉素抗性基因。这个基因因为一个提前出现的终止密码子而失效，导致细菌无法在含有卡那霉素的培养基上生长。研究人员的目标是修复这个终止密码子，恢复细菌的抗性。为了实现修复，他们同时提供了一个修复模板（repair template）质粒，该模板上携带着正确的DNA序列。

实验结果令人振奋。研究人员比较了不同编辑策略的效果：

首先，单独使用nScCas9切口酶的对照组效率不高，只有约5.1%的细胞成功获得了卡那霉素抗性，表明仅靠切口不足以高效驱动同源重组（Homologous Recombination, HR）。

其次，使用标准Cas9制造DSB的对照组，虽然能筛选出高达76%的阳性菌落，但代价是巨大的细胞毒性，菌落总数减少了153倍。

最后，使用 附加编辑 系统的实验组表现出极高的编辑效率和极低的细胞毒性。高达97%的菌落成功获得了抗性，且总菌落数几乎未受影响。

这一对比有力地证明了 附加编辑 策略的优越性。ADPr修饰与DNA切口的协同作用，极大地促进了细胞利用外源模板进行同源重组的意愿。为了进一步探索其应用边界，研究人员挑战了更复杂的编辑任务，即在没有筛选压力的情况下，进行大片段的DNA序列替换、删除和插入。结果显示，该系统同样表现出色。例如，在目标位点进行长达91 bp的序列替换时，在筛选的菌落中，有50%到75%的菌落检测到了完全或部分的序列替换。这表明，在细菌中， 附加编辑 是一种极其强大且灵活的基因组工程工具，适用于多种复杂的编辑场景。

当研究人员将目光从原核生物转向真核生物时，一个核心问题摆在了面前：这种依赖于复制停滞和同源重组的修复机制，在真核细胞中是否同样有效？真核细胞的DNA修复网络远比细菌复杂，它们对不同损伤的响应策略也不尽相同。

研究人员首先在酿酒酵母（S. cerevisiae）中重复了类似的实验。他们选择FCY1基因为靶点，试图通过提供修复模板来引入一个6 bp的替换。

实验结果出现了第一个 意外 。与细菌中近乎完美的表现相反， 附加编辑 在酵母中驱动同源重组的能力非常有限。在使用修复模板的情况下，只有17%的筛选菌落中发生了预期的模板化编辑。相比之下，使用标准Cas9制造DSB的对照组，其模板化编辑效率达到了50%。这表明，在酵母中，同源重组并非修复ADPr损伤的首选途径。

那么，如果细胞不进行同源重组，它们是如何处理这个ADPr 路障 的呢？对那些未发生模板化编辑的菌落进行测序后，研究人员发现了第二个，也是更令人兴奋的 意外 ：在没有模板指导的情况下，细胞在ADPr修饰位点发生了高频的碱基突变。具体来说，被修饰的目标胸腺嘧啶（T）发生了转换，其中约67%转变成了腺嘌呤（A），约33%转变成了胞嘧啶（C）。

为了验证这一发现，研究人员移除了修复模板，结果发现T A和T C的突变频率反而进一步提高了。这证实了两种修复途径，同源重组和碱基诱变，处于相互竞争的关系。在酵母细胞中，面对ADPr损伤，细胞似乎更倾向于启动一种具有诱变性的修复途径。

紧接着，研究人员在本氏烟草（N. benthamiana）植物细胞中进行了验证。他们靶向植物的PDS1基因，并且不提供修复模板。结果再次证实了酵母中的发现：在目标胸腺嘧啶位点观察到了显著的碱基突变。突变类型同样表现出明显的偏好性，T A的转换占主导地位（在一个位点中占59%），其次是T C和T G。重要的是，这种编辑方式产生的插入缺失突变（indels）频率极低。

从细菌到酵母再到植物，实验结果清晰地描绘出了一条戏剧性的 进化分岔路 ：在细菌中，ADPr损伤引发高效同源重组；而在真核生物中，则主要导致碱基诱变。

这种差异很可能源于真核细胞中更为复杂的跨损伤合成（Translesion Synthesis, TLS）机制。当复制叉遇到损伤时，细胞会招募一些 粗心 的特殊DNA聚合酶强行越过损伤位点，从而导致突变。对于研究人员而言，这种转变虽然出人意料，但却开辟了一个全新的应用方向：利用 附加编辑 在真核细胞中实现特定类型的碱基突变，尤其是目前技术难以实现的T A转换。

在将 附加编辑 技术应用于哺乳动物细胞之前，研究人员必须面对一个关键的挑战。在长期进化过程中，人类细胞同样演化出了应对DNA ADP核糖基化损伤的机制。其中一个关键蛋白是TARG1（也称为OARD1），它是一种高效的ADPr去修饰酶。TARG1就像一个尽职尽责的 守门员 ，一旦发现DNA上被附加了ADPr基团，就会迅速将其移除。

这意味着，在正常的人类细胞中， 粘贴 上去的ADPr标记可能在引发修复反应之前就被TARG1清除了。为了验证这一点，研究人员在人胚胎肾细胞系（HEK293T）中进行了对比实验，他们构建了TARG1基因敲除细胞系，并与野生型细胞进行比较。

实验结果完全符合预期。在野生型HEK293T细胞中， 附加编辑 几乎无法诱导任何碱基突变。然而，一旦敲除了TARG1基因，情况发生逆转：在目标胸腺嘧啶位点，碱基突变频率显著提升。例如，在EMX1基因靶点，突变频率从几乎为零跃升至约9%。这一结果证实TARG1是阻碍 附加编辑 在人类细胞中发挥作用的主要障碍。

克服了TARG1的障碍后，研究人员得以详细探究 附加编辑 在人类细胞中的编辑特性。

编辑的精准性与窗口： 附加编辑 的突变高度集中在DarT2识别基序内的目标胸腺嘧啶上。研究人员发现，编辑主要发生在sgRNA引导序列的第3位到第9位核苷酸范围内。这种高度的局域性使其具有很高的可预测性，减少了对邻近碱基的 误伤 。

序列偏好性与T A的实现：与酵母中的观察结果类似，突变的类型受到局部DNA序列环境的影响。研究人员发现，特定的基序（如5 -TCTN-3 ）倾向于产生T A和T C的混合结果；而另一些基序（如5 -TTTN-3 ）则强烈偏好T A转换。这一点具有重要的应用价值。 附加编辑 提供的T A转换能力，填补了现有工具箱的一块重要空白。

安全性分析：安全性是基因编辑技术的核心考量。研究人员评估发现，与标准Cas9相比， 附加编辑 产生的indel频率极低，比Cas9低了22倍。更重要的是，通过巧妙的对照实验，研究人员证实该工具具有高度的靶点特异性，并未在非靶向区域引起额外的碱基突变。

这项研究巧妙地将细菌免疫防御机制转化为一种新型基因编辑技术，其核心贡献在于展示了 附加编辑 这一全新概念，并揭示了其在不同生命域中的独特应用潜力。

因地制宜 的编辑策略：本研究最引人深思的发现是，完全相同的DNA加合物在细菌和真核生物中引发了截然不同的细胞应答。在细菌中，它是一种高效的同源重组驱动器；而在真核生物中，它转变为一种碱基诱变器。这种 情境依赖性 的编辑结果，凸显了细胞内源DNA修复通路在基因编辑中的决定性作用。

拓展工具箱的边界：对于细菌基因工程而言， 附加编辑 提供了一种不依赖DSB、毒性低、灵活性高的编辑方案。对于真核生物研究，T A编辑能力的解锁具有重要意义。例如，在ATM基因中，存在多个致病的T C突变位点，使用传统的ABE编辑器修复会不可避免地导致不期望的结果。而ADPr-TAE凭借其对特定基序的识别和低旁观者效应，有潜力实现更精准的修复。

挑战与未来的方向：TARG1蛋白的存在是 附加编辑 技术在人类细胞中应用的主要障碍。未来的临床应用中，需要开发瞬时抑制TARG1活性的方法，例如使用小分子抑制剂或siRNA干扰技术。此外，DarT2对特定DNA基序的识别限制了其靶向范围，未来的工作可以通过蛋白质工程或挖掘更多样的细菌毒素来改造其识别序列，使其能够靶向更广泛的基因组位点。