先导编辑（PE）技术能够实现精确的核苷酸改变，但由于其编辑效率较低，在高通量功能筛选中的应用受到限制。

2026年6月5日，上海科技大学黄行许，Shang-Min Zhang和南京医科大学Shisheng Huang共同通讯在Science Advances 在线发表题为“Uncovering functional variants using a high-efficiency PE3-based screening platform”的研究论文。该研究开发了EvoPRIME，这是一个基于PE3的筛选平台，该平台整合了Csy4介导的Pol II驱动导向RNA的加工过程，以及基于荧光的富集策略。EvoPRIME能够达到与当前最先进先导编辑系统相当的效率，且无需抑制错配修复（MMR）。作者通过针对必需基因的功能缺失（LOF）缺失筛选验证了EvoPRIME的性能，该筛选显示出更高的灵敏度和可重复性。

此外，在奥希替尼选择压力下对EGFR酪氨酸激酶结构域进行的功能获得（GOF）饱和诱变筛选，鉴定出了已知和未表征的耐药突变。借助EvoPRIME，作者进一步开展了一项高通量筛选，该筛选能够功能性评估磷酸化功能获得（GOP）和磷酸化功能缺失（LOP）突变。在筛选出的结果中，GAB1 S419E作为一种模拟磷酸化突变，能够激活AKT信号通路并赋予奥希替尼耐药性。这些研究确立了EvoPRIME作为一个多功能平台，可用于揭示功能性变异体。

CRISPR-Cas技术革新了功能基因组学领域，为全基因组功能筛选以解析基因型-表型关系提供了强大平台。虽然传统CRISPR-Cas9敲除筛选能够有效鉴定基因水平的功能效应，但缺乏解析单核苷酸变异或单一氨基酸改变的分辨率。为克服这一局限性，碱基编辑（BE）与先导编辑（PE）通过实现精准、可编程的核苷酸水平修饰扩展了CRISPR的应用范围。近期，多项研究利用这些工具对人工核苷酸变异开展了大规模表型表征，加深了对其功能影响的理解。然而，这些技术仍存在一定局限性。

BE受限于其原型间隔子邻近基序（PAM）要求及编辑范围，仅能实现特定的转换突变（C→T或A→G）。此外，活性窗口内的非预期旁观者编辑会降低编辑精度。相比之下，PE可实现所有可能的核苷酸置换及小片段插入与缺失，提供了广泛的编辑灵活性。然而，即使在传统PE2系统背景下使用经过优化的工程化先导编辑向导RNA（pegRNA），其相对较低的效率仍是主要限制因素。PE3系统通过引入额外的切口单链向导RNA（sgRNA）提高了编辑效率，但增加了文库构建的复杂度与成本。另一种策略是通过抑制或敲除MutL同源物1（MLH1）进一步增强编辑效率。但这需要使用工程化细胞系，不仅涉及额外实验步骤，还可能因破坏错配修复（MMR）通路而影响基因组稳定性。因此，每个靶位点通常需要多个pegRNA，这进一步增加了实验复杂度与成本，最终限制了PE在高通量功能筛选中的可扩展性。

图1.EvoPRIME能够有效地引入氨基酸取代（摘自Science Advances）

为应对这些挑战，作者开发了EvoPRIME平台。该平台基于PE3系统，利用Csy4介导的RNA聚合酶II（Pol II）驱动转录本的加工过程，该转录本同时携带pegRNA与切口sgRNA，并结合基于荧光富集的策略以提高编辑效率，从而在无需敲除MLH1或抑制MMR的条件下实现高通量功能筛选。作者首先使用针对必需基因的基于dropout的失功能（LOF）筛选对EvoPRIME进行基准测试，结果表明与常规PE3系统相比，其灵敏度和可重复性均有提升。随后，作者在奥希替尼筛选条件下，对表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶结构域进行了获功能（GOF）饱和诱变筛选，以鉴定赋予耐药性的变异。接下来，作者针对通过野生型与奥希替尼耐药细胞间比较磷酸化蛋白质组学分析所鉴定的磷酸化位点，进行了磷酸化获得（GOP）与磷酸化丢失（LOP）筛选，揭示了关键功能磷酸化位点。在此基础上，作者鉴定了一个此前未被表征的磷酸化位点——GRB2相关结合蛋白1（GAB1）S419，并发现其磷酸化模拟突变能够激活蛋白激酶B（AKT）信号通路，并抑制PC9细胞反映奥希替尼作用的细胞凋亡。

参考消息：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.ady7359